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Una guía que indica el paso a paso para mejorar la fotografía en microscopios

Taller para mejorar la calidad de las imágenes microscópicas:

1. Enfocar bien la imagen
2. Seleccionar una cámara digital apta para su uso en microscopía
3. Evitar las vibraciones al disparar
4. Usar la función anti-choque (bloqueo/cierre del espejo) en las cámaras digitales réflex (DSLR)
5. Usar microscopios de alta calidad del tipo óptica “corregida a infinito”
6. Se recomienda utilizar objetivos o lentes microscópicas de alta calidad
7. Un tiempo de exposición óptimo aumenta su nitidez
8. En la macroscopía: todo dependerá de la iluminación – si existe una buena iluminación esta hace visibles las estructuras espaciales 
9. Iluminación en microscopía
10. Iluminación óptima: la iluminación con LED revoluciona la microscopía
11. Se considera un imperativo la utilización de fuentes de alimentación estabilizadas
12. En macroscopía se precisa el ajuste de la cámara con un “nivel”
13. Aumentar el contraste con pigmento
14. La desactivación del disparador de bloqueo cuando se utiliza una cámara con lentes intercambiables montadas en el microscopio
15. La utilización de un filtro de a luz del día y el balance de blancos
16. Ajuste parfocal

1. Enfocar bien la imagen:

Cámaras con Live View (Visión en Directo):

El primer paso es enfocar la imagen utilizando el ajuste grueso y fino, mientras mira a través del ocular del microscopio. Otro ajuste fino se puede realizar con la ayuda la pantalla LCD propia de la cámara (o mediante un monitor con control externo). Ahora, gire el botón de ajuste fino foco del microscopio hasta conseguir que la imagen se muestre de la forma más óptima posible. La función de aumento de la cámara es de gran importancia.

Simplemente con presionar un botón, se consigue ampliar el encuadre de la imagen. Dependiendo del modelo de la cámara, los encuadres se pueden ampliar ¡hasta 15 veces su tamaño original!

Esta función hace posible mostrar pequeños detalles en la pantalla de la cámara. Si no se usa la función de aumento, existe el riesgo de no detectar pequeñas imprecisiones o desenfoques, dado que la pantalla de aproximadamente 1 megapíxel tiene mucho menos megapíxeles, que el chip sensor, el cual puede procesar imágenes de hasta 25 megapíxeles. Por esta razón, es muy difícil fijar el nivel de enfoque con exactitud sin la función de aumento. Asimismo, se recomienda usar la función de aumento cuando se esté trabajando con un monitor externo HD a través del puerto HDMI. El estándar Full HD (1920 x 1080 píxeles) tan sólo contiene unos 2 Mb.

Las cámaras sin la función Live View (Visión en Directo):

En primer lugar, enfoque la imagen utilizando el ajuste grueso y fino, mientras mira a través del ocular del microscopio. Precisamente la mejor manera de ajustar el enfoque exacto es a través del visor óptico y mediante el ajuste fino del microscopio. Un visor de ángulo con una lente de aumento o un visor electrónico (p. ej. Zigview) le facilitará enormemente el enfoque. Sin embargo, este equipo es relativamente caro.

2. Seleccionar una cámara digital apta para su uso en microscopía

No todas las cámaras digitales trabajan igual de bien con un microscopio. Con frencuencia se consiguen mejores resultados con  cámaras más económicas  e incluso modelos más antiguos que los modelos de cámaras ultramodernos más recientes. En nuestra página  web hemos recopilado en un listado las cámaras más aptas con el fin de que le ayude a elegir la cámara que mejor se adapte a sus necesidades. Además, encontrará un resumen de las características generales de la cámara que son especialmente importantes para el examen microscópico. Actualizamos este ranking de cámaras periódicamente con la mayor objetividad posible, ya que no tenemos cámaras en nuestra propia gama de productos.

Si se usa una cámara réflex digital pueden producirse al accionar el disparador vibraciones no deseadas cuando se pliega hacia arriba el espejo, y como consecuencia de ello afectar considerablemente la calidad de las imágenes tomadas. No obstante, en la mayoría de las cámaras réflex digitales se puede activar en el menú una función de bloqueo de espejo SRL antes de la exposición.  Al activar esta función, el espejo de la cámara se pliega inmediatamente al tomar la imagen, en cambio el disparo se efectúa tras una breve pausa. Esta opción en el menú tendrá una denominación diferente según el fabricante de la cámara.

•  En las Canon: bloqueo del espejo
•  En las Olympus: anti-choque

En las cámaras con un sistema de montaje de lentes intercambiables sin espejo, o con un espejo semitransparente, apenas se producen vibraciones.

5. Usar microscopios de alta calidad del tipo óptica “corregida a infinito”

Realizar fotografías con los antiguos microscopios con sistema óptico "finito"

Para lograr la máxima flexibilidad, los adaptadores de microscopio LM no realizan ninguna función compensatoria. Cuando se monta un nuevo adaptador de microscopio LM en microscopios antiguos < 1985) o en microscopios nuevos con un sistema óptico "finito", pueden aparecer en los bordes de la imagen zonas desenfocadas, ya que las lentes en este diseño de microscopio no están totalmente corregidas. Sólo el ocular corrige los errores residuales de la lente. Diversos fabricantes de microscopios e incluso algunas series de microscopios con un sistema óptico "finito" disponen de lentes especiales de compensación. Con estas lentes, cada microscopio es capaz de corregir separadamente la imagen siguiendo el principio  lock and key (“cerradura y llave”).

En este caso, el adaptador de microscopio tendría que corregir los errores individuales de cada uno de los instrumentos con un sistema óptico "finito" con el objetivo de mantener una alta calidad de la documentación fotográfica. Desafortunadamente, esto no es posible, ya que hay cientos y cientos de diferentes microscopios en el mercado. Si lo desea puede solicitarnos que le proporcionemos información acerca de cada uno de ellos con soluciones personalizadas. Para imágenes de alta calidad por lo tanto, recomendamos utilizar microscopios del tipo óptica “corregida a infinito”. 

Los microscopios modernos y de gama alta con óptica “corregida al infinito” disponen de sistema óptico totalmente corregido anterior al ocular, y los errores de la imagen del objetivo se corrigen mediante una lente de  tubo en el microscopio, de modo que el ocular ya no tiene que realizar las correcciones. Estos microscopios son idóneos para la documentación fotográfica y la documentación en vídeo, ya que proporcionan una altísima calidad.

6.Se recomienda utilizar objetivos o lentes microscópicas de alta calidad

Durante el examen visual a través del ocular, a menudo pasan inadvertidos los defectos de la imagen. En las fotografías, sin embargo, esos errores son mucho más evidentes en detrimento de la calidad de la imagen. Los errores más frecuentes en la  imagen son cromaticidad espuria marginal y líneas de bordes borrosos. Esta discrepancia en la percepción se debe a la capacidad de acomodación del ojo humano. El ojo es capaz de eliminar los errores de la imagen, mientras que la cámara, desafortunadamente, no puede.

Con el fin de corregir los defectos en la imagen lo más ampliamente posible, es necesario al emplear objetivos de gama alta el uso de un modelo de lente muy complejo y costoso. Deberían corregirse todos los colores de la luz visible, por lo tanto no puede haber aberraciones cromáticas longitudinales.

Mediante las lentes apocromáticas, se proyectan en el punto focal todos los colores con exactitud.

La denominación "plano" indica que la lente plana ofrece una imagen intermedia, donde las curvaturas del campo de la imagen son niveladas. Si no existe tal corrección, la imagen se hará cada vez más difusa hacia los bordes.

La descripción adicional de "fluorita" indica se está usando unas lentes especiales de fluorita. Utilizando un modelo de objetivo que es bastante sencillo en comparación con las lentes apocromáticas, se pueden corregir las aberraciones cromáticas longitudinales. Este tipo de lente, cuyo diseño es sencillo y con un menor número de lentes, proporciona relativamente una intensidad luminosa y unos contrastes de niveles altos, lo que resulta especialmente útil para los métodos de contraste (fluorescencia, etc. ). 

		Ventaja	Desventaja
	Lentes Acromáticas	precio económico montaje simple amplia distancia de trabajo apto para casi todos métodos microscópicos	corrige sólo los campos amarillos y verdes curvaturas del campo aún visibles
	Lentes Plan Acromáticas	montaje simple curvaturas del campo corregido amplia distancia de trabajo apto para casi todos métodos microscópicos	precio corrige sólo los campos amarillos y verdes
	Lentes "Semi Plan Acromáticas" Lentes "Micro Plan Acromáticas" lentes acromáticas con campo mejorado	precio económico montaje simple curvatura del campo en el centro de la imagen amplia distancia de trabajo apto para casi todos métodos microscópicos	precio corrige sólo los campos amarillos y verdes curvatura del campo aún visibles en el borde de la imagen
	Lentes Fluorita	montaje simple excelente corrección cromática intensidad luminosa y contraste alto apto para todos métodos microscópicos	precio curvatura del campo distancia de trabajo reducida
	Lentes Plan Flourita	montaje relativamente sencillo excelente corrección cromática curvatura del campo reducida alta resolución intensidad luminosa y contraste alto apto para todos métodos microscópicos	precio distancia de trabajo reducida
	Lentes Apocrómaticas	mejor corrección cromática abertura numérica más alta	precio curvatura del campo intensidad de la luz y contraste algo menor que las lentes fluoritas distancia de trabajo reducida
	Lentes Plan Apocrómaticas	mejor corrección cromática alta resolución no curvatura del campo	precio intensidad de la luz y contraste algo menor que las lentes fluoritas no apto para todas las técnicas de imagen microscópica debido a su complejo diseño óptico distancia de trabajo reducida

7. Un tiempo de exposición óptimo aumenta su nitidez

Las vibraciones se pueden reducir al acortar los tiempos de exposición. Incluso la más mínima vibración del microscopio o de la cámara, empeora considerablemente la calidad de la imagen. Sin embargo, no todos los métodos microscópicos permiten tiempos de exposición breves, más bien no soporta el incremento de la intensidad de la iluminación como resultado de ello. Las células vivas, por ejemplo, reaccionan con mucha sensibilidad frente a la energía de la radiación de las lámparas. En cambio, al usar técnicas con poca iluminación, tales como la fluorescencia polarización o microscopía de contraste por etapas, la luz que penetra en la cámara es mínima, lo que aumenta las exigencias relativas a la sensibilidad del sistema de proceso de imágenes, lo que implica la necesidad de alargar los tiempos de exposición.

Las cámaras digitales modernas disponen de funciones automáticas de exposición inteligente. Con el modo de exposición automático, la cámara selecciona de forma autónoma el tiempo de exposición correcto y elige la duración más corta posible. Mediante los botones "más" y "menos" (ajustes de exposición), es posible modificar la exposición. La imagen aparecerá a elección del usuario más clara o más oscura.

Cuando estos modelos son usados en un microscopio, el tiempo de exposición debe de configurarse manualmente ya que no mantienen por defecto una exposición en automático.

8. En macroscopía: una buena iluminación hace visibles las estructuras espaciales

Utilizando una iluminación óptima las estructuras aparecen de forma clara y con detalle en la platina donde esta depositado el espécimen. La interacción entre las zonas claras y oscuras hace visible las estructuras espaciales. Un fotógrafo con experiencia sabe como iluminar de forma óptima un objeto a retratar. Dependiendo del campo de aplicación y las condiciones, se pueden emplear un extenso repertorio de técnicas de iluminación con una gran variedad.

Las siguientes técnicas son recomendables para fotomacrografía:

• Luz frontal (0° - 20°)
• Luz lateral (20° - 80°)
• Reflejo de luz (80° - 100°)
  Luz cenital
• Luz inferior

9. Iluminación en microscopía

Las siguientes técnicas de iluminación son relevantes en microscopía:

•  Luz transmitida: El rayo luminoso incide en el espécimen perpendicularmente desde abajo, pasa a través del mismo y es captado de nuevo al otro lado gracias a la lente. Esta técnica es estándar en microscopía.
•  Luz refleja: Con la luz refleja -a diferencia de luz transmitida – el rayo luminoso no pasa a través del espécimen, sino que incide en el especimen desde arriba. Esta técnica se utiliza con  capas gruesas y especímenes impermeables.

Métodos de iluminación para aumentar el contraste:

• Campo claro
• Campo oscuro
• Contraste de polarización
• Contraste por interferencia diferencial (CID)
• Contraste de flourescencia
• Contraste de fases

10. Iluminación óptima: la iluminación con LED revoluciona la microscopía

La tecnología LED es la técnica de la iluminación más avanzada. Se distingue por  su eficiencia energética (12% en blanco), por su espectro estrecho y por el poquísimo espacio que necesita. Dado que las lámparas LED emiten muy poca radiación de calor (IR), es la mejor opción como fuente de luz para el uso en microscopios, ya que así se evita el innecesario calentamiento de los especímenes vivos en la pletina porta especímenes (p.ej. cultivos celulares). Incluso el sensor de la cámara se calienta mucho menos en comparación con las fuentes luminosas convencionales (lámparas de incandescencia, lámparas halógenas), lo que supone una ventaja, ya que permite reducir el ruido de la imagen. 

Representa también una gran ventaja en aquellos procesos especiales en los que se utilizan cámaras enfriadas,  cuando sólo las partes indispensables de luz, son las que realmente inciden en la cámara. Un tono de color blanco frío es idóneo para la microscopía y reproduce en la fotografía colores brillantes.

Con anterioridad a la era del LED, los microscopios estaban principalmente equipados con lámparas halógenas. En comparación con las lámparas de incandescencia normales son capaces de generar una mejor temperatura de color y son más eficaces. Sin embargo, con un coeficiente de eficacia del 3%, las lámparas halógenas en comparación con las luces LED (12% en color blanco), son claramente peores. La energía restante (97%) se transforma en calor y ha de ser liberada a través del microscopio.

11. Se considera un imperativo la utilización de fuentes de alimentación estabilizadas

Una fuente de alimentación estabilizada es muy recomendable para conseguir una documentación fotográfica de alta calidad. Por desgracia, las fuentes de alimentación rara vez se usan. Esto se nota en particular al grabar vídeos digitales, ya que pueden aparecer en el vídeo el fenómeno del parpadeo (flicker) o patrones de franjas como resultado de una fuente de alimentación insuficientemente estabilizada.

Tales efectos son causados por la interacción entre las fluctuaciones en el voltaje de la corriente alterna y el proceso cíclico de la recogida de datos del sensor de la cámara. En la mayoría de los casos, la calidad de la imagen no se ve afectada a causa de las fluctuaciones de tensión. Los sistemas de exposición automática inteligente de las cámaras digitales modernas generalmente no suelen tener problema con esto.

12. En macroscopía se precisa el ajuste de la cámara con un “nivel”

La base del macroscopio deben formar un ángulo recto con el eje óptico de la unidad de cámara. Antes de comenzar a tomar las imágenes, un pequeño nivel se deben utilizar para comparar ambas superficies; de lo contrario podría producirse un detrimento en la nitidez no deseado.

13. Aumentar el contraste con pigmento

Con especímenes incoloros y  transparentes a menudo resulta muy difícil hacer los detalles de la muestra visibles. Las imágenes parecen incoloras y carentes de detalles. La tinción es una técnica que puede emplearse para mejorar el contraste de la imagen y hacer visibles las estructuras.

14. La desactivación del disparador de bloqueo cuando se utiliza una cámara con lentes intercambiables montadas en el microscopio.

En algunas cámaras está activada en el menú la función de bloqueo del disparador al usar una lente de otro fabricante. Dicha función de bloqueo debe desactivarse al trabajar en el microscopio.

15. La utilización de un filtro de a luz del día y el balance de blancos

En caso necesario, puede insertar un filtro de la luz del día (luz azul) en la trayectoria del haz luminoso o utilizar los controles de la cámara para ajustar el balance de blancos.

16. Ajuste parfocal ¿Cómo puedo enfocar simultáneamente la imagen en el ocular y en la cámara?

FAQ_32_en.html